LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Son varios los métodos empleados para la determinar el límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ), dependiendo si el procedimiento es instrumental o no instrumental.
Siempre que un método analítico se emplee en la determinación de impurezas o trazas de un principio activo es recomendable de entrada establecer LOD y LOQ.

Metodología

Basado en la evaluación visual.

Esta puede ser usada en los dos diferentes tipo de métodos instrumentales y no instrumentales. Se determina a partir de análisis de muestras de concentraciones conocidas y decrecientes del analito. Estableciéndose visualmente la mínima cantidad de analito detectada y cuantificada. Este se emplea mucho en método de cromatografía de capa fina o TLC.

Basado en la Señal-Ruido.

Este procedimiento aplica a métodos que utilizan instrumentos para medir la respuesta analítica y presentar una señal de ruido basal.

Un analista debe preparar 3 soluciones blanco (reactvos, placebos analíticos, etc. según proceda) y determinar su respuesta por duplicado; si el método es espectrofotométrico o se utiliza algún tipo de blanco, las lecturas se hacen contra estos blancos establecidos en el método.
Conjuntamente debe preparar muestras (de placebo más analitos) en un intervalo que comprenda el límite de detección o cuantificación requerido; dicho intervalo debe poseer 5 niveles de calibración, dos por debajo y dos por encima del LOD o LOQ establecido.
Determinar aquella cantidad del analito que genere una respuesta con respecto a la muestra blanco en una proporción de 3 a 1 para el límite de detección y de 10 a 1 para el límite de cuantificación.

Basado en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente.

El límite de detección puede ser expresado como:El límite de cuantificación puede ser expresado como:Donde.
σ = desviación estándar de la respuesta
S = La pendiente de la curva de calibración
La pendiente S puede ser estimada a partir de la curva de calibración de soluciones diluidas del analito.
La estimación de σ puede determinarse de varias formas:

Basado en la desviación estándar de un blanco. Mide la magnitud de la respuesta de fondo analítica realizado por el análisis de un número apropiado de blanco de muestras (placebo) y calculando la desviación estándar de estas respuestas.

Basada en la curva de calibración. Una curva de calibración específica debe ser estudiada usando muestras que contengan el analito en el rango del LOD y LOQ, la desviación estándar residual de la línea de regresión o la desviación estándar de y-intercepto de la línea de regresión puede ser usada como desviación estándar.

Basado en el método experimental de Eurachem.

Este se aplica cuando no existe la posibilidad de tener una muestra placebo o cuando ya tenemos un valor fijado para LOQ, consiste en preparar una serie de muestras con cantidades decrecientes de analito y analizar cada una de ellas 6 veces consecutivas, representando CV(%) de la precisión frente a la concentración de cada muestra.

Normalmente se fija un criterio de precisión de un CV=10% en el límite de cuantificación.

Basada en los márgenes establecidos en la tabla de la AOAC 1993.

Independientemente del enfoque utilizado, el límite de cuantificación debería validarse posteriormente mediante el análisis de un número adecuado de muestras que se sepa que están cerca del LOD o LOQ o fueron preparadas a este límite.

Criterios de aceptación

• El límite de detección debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas límite.


• El límite de cuantificación debe ser menor a la especificación del contenido / valoración de la prueba de impurezas.

TRANSFERENCIA DE METODOS ANALÍTICOS

Antes de desarrollar cualquier transferencia de método para cualquier materia prima o producto terminado, debe haber un protocolo establecido.
Algunos lineamientos a ser direccionados en cada protocolo de transferencia son los siguientes:

1. La transferencia debe ser desarrollada en dos lotes, con tres preparaciones de muestra para cada lote. Idealmente lotes no comerciales y que contengan algún nivel de impurezas.


2. Valor medio para la valoración entre laboratorios debe ser 2% para materias primas y 3% para producto terminado.


3. La precisión debe cumplir con los requerimientos intralaboratorios SST (Solución para adecuabilidad del Sistema)


4. Para determinación de impurezas conocidas, la diferencia absoluta debe ser no mayor a 0.2%. Precisión (SST) debe ser de 10-15% para las impurezas conocidas.


5. Para impurezas desconocidas allí deben ser confirmados cualitativamente.


6. Para forma farmacéutica de administración oral, el valor de disolución medio debe ser de 6% y el valor de uniformidad de contenido medio debe ser de 5%.


7. Para métodos compéndiales el laboratorio debe verificar que el método puede ser desarrollado y que no interfieren sustancias extrañas.

El laboratorio de transferencia debe incluir la siguiente documentación:

1. Método finalizado


2. Reporte de Desarrollo de método


3. Reporte de validación o resumen de validación


4. Protocolos de transferencia y criterios de aceptación

El protocolo de transferencia puede ser aprobado por todos los laboratorios involucrados en la transferencia.

La documentación que se maneja en el reporte de transferencia, debe indicar si la transferencia fue exitosa o no. Este consiste en un protocolo completo, un resumen de los resultados y referencia de los datos crudos entre ambos sitios y libros de referencia. Cualquier desviación del protocolo debe ser reportado.
Guía para realizar el plan de transferencia de la metodología analítica:

1. Responsabilidades claras de cada parte


2. Propósito. Lista de todos los métodos a ser transferidos para los productos e indicar los métodos de los productos no incluidos en la transferencia


3. Alcance


4. Materiales requeridos en la transferencia. Los estándares deben ser suministrados con su certificado analítico


5. El protocolo de transferencia


6. Criterios de Aceptación para todas las pruebas


7. Documentación de transferencia de método


8. Copias de los métodos


9. Requerimientos y forma final del reporte

PRECISIÓN

La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente a múltiples muestreo de una muestra homogénea. La precisión de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La precisión puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetibilidad del procedimiento analítico en condiciones normales de operación.

La precisión se divide así:

Metodología

Los documentos ICH recomiendan que se evalúe la repetibilidad utilizando un mínimo de nueve determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) o un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba.
Esta se determina mediante el análisis de un número suficiente de alícuotas de una muestra homogénea, estos son realizados con muestras independientes y deben ser llevados a cabo mediante el procedimiento analítico completo, desde la preparación de las muestra hasta el resultado final de las pruebas, estos análisis permiten calcular estimaciones validas de la desviación estándar, o de la desviación estándar relativa (%RSD).

Precisión Nivel I(Repetición Instrumental)

En este ensayo se evalúa el desempeño del instrumento y la repetición en la inyección o en la medida con una muestra del producto.
Se prepara una muestra del producto y se realizan 10 determinaciones de la misma muestra (si es por HPLC, 10 inyecciones del mismo vial) y al final se calcula el RSD de los 10 datos, los análisis los realizan un mismo analista, bajo las mismas condiciones.

Criterios de aceptación
El RSD no debe ser mayor del 1 % para valoración de materia prima y producto terminado y en el caso de impurezas no mayor del 5%.

Precisión Nivel II(Repetición del Método)

Se propone dos alternativas para realizar este estudio:
-Un mínimo de 6 muestra a la concentración nominal.
-Un mínimo de tres muestras a tres niveles de concentración cubriendo el intervalo especificado (un total de 9 muestras)

Criterios de Aceptación
-Para las pruebas de valoración y uniformidad de contenido.
En ingrediente activo el %RSD obtenido para 6 muestras debe ser menor o igual a 2.0%.
En producto farmacéutico el % RSD obtenido para 6 muestras debe ser menor o igual a 2.0%.
-Para la prueba de Disolución. La desviación estándar relativa obtenida para 6 muestra debe ser menor o igual a 2.0%, teniendo en cuanta el Q establecido.
-Sustancias relacionadas o determinación de impurezas.

Precisión Intermedia

Este test es de la precisión intermedia (tolerancia o fortaleza) día/analista. Se deben considerar aquellas circunstancias en las que se pretende desarrollar el método de ensayo. Se debe evaluar los efectos usados o generados al variar una serie de factores.
La metodología consiste en analizar por triplicado una muestra homogénea del producto que tenga un nivel cercano o igual al 100% (en el caso de potencia/ contenido/valoración) o una muestra homogénea cuyo contenido este incluido en el intervalo lineal de concentración de linealidad del método (para el caso de impurezas), en dos días diferentes y por dos analistas diferentes.
En disolución se recomienda emplear un lote bien caracterizado de producto farmacéutico con estrecha uniformidad de contenido, sino se dispone de este lote emplear placebo cargado con activo.

Criterios de aceptación
-Para las pruebas de valoración y uniformidad de contenido. El %RSD debe ser menor o igual a 2.0%, n mayor o igual a 4 (para dos analistas en días diferentes)
-Para la prueba de Disolución. La diferencia entre el valor medio entre los resultados de disolución en cualquiera de las dos condiciones que empleen la misma concentración no excede un 10% absoluto en tiempos con menos del 85% y no excede de 5% para los tiempos por encima de 85%. Los criterios de aceptación pueden referirse a un producto específico y pueden emplearse otros límites y pruebas estadísticas.
-Sustancias relacionadas o determinación de impurezas.

EXACTITUD DEL MÉTODO

La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante este procedimiento y el valor verdadero. La exactitud de un procedimiento analítico debe establecerse en todo su intervalo

Metodología

Los documentos ICH recomiendan que se evalúe la exactitud utilizando un mínimo de 9 determinaciones, sobre un mínimo de 3 niveles de concentración, cubriendo el intervalo especificado.

En la valoración de un principio activo (materia prima):

1) La exactitud puede determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza conocida. (por ejemplo estándar de referencia)
2) Se puede determinar por comparación de los resultados del procedimiento (interno) con los de un segundo procedimiento bien caracterizado (farmacopéico), cuya exactitud se haya comprobado o definido. La comparación se realiza con los resultados obtenidos con el método analítico que se quiere validar con los obtenidos por un método de referencia. Se realizan seis determinaciones por método, el que requiere ser evaluado y el oficial o farmacopéico, se emplea los estadísticos de comparación de dos medias de series no apareados (test de F y test de t, con la varianza conjunta).

Determinación de la exactitud en un producto terminado:

1) Se puede evaluar directamente en producto terminado, el cual previamente ha sido analizado y se conoce exactamente la concentración. A partir del producto se preparan 3 niveles de concentración en el rango de estudio, y cada concentración se analiza como mínimo tres veces, y se evalúa el porcentaje de recuperación con respecto al valor esperado.
2) Método del placebo cargado. Se prepara un placebo del problema que contiene todos los ingredientes excepto el analito a determinar, sobre dicho placebo se añaden cantidades conocidas de un analito patrón (estándar secundario) a tres niveles de concentración, dentro de rango a estudiar. El ensayo de recuperación se realiza como mínimo con 3 replicas para cada nivel, el analito se determina en cada muestra utilizando el mismo método analítico a evaluar y se calcula la recuperación.
3) Método de adición de patrón. Se utiliza esta aproximación cuando no es posible preparar un placebo de la matriz de la muestra que no contenga el analito. Se añaden sobre una o varias muestras cantidades conocidas de un analito patrón a tres niveles de concentración dentro de rango a estudiar.
4) En casos de las pruebas de disolución el capitulo 1092 de la USP 30, recomienda que en casos de poca solubilidad del medicamento, puede que sea apropiado preparar una solución madre que consiste en la disolución del fármaco en una pequeña cantidad de disolvente orgánico (generalmente que no exceda de 5%) y su disolución final a la concentración final con el medio de disolución. Se puede agregar al vaso una cantidad de solución madre equivalente a la cantidad declarada específicamente elegida, en el lugar del fármaco en polvo.
5) En casos de análisis cuantitativo de impurezas, la exactitud debe evaluarse en muestras (del fármaco o del producto farmacéutico) a las que se hayan agregado cantidades conocidas de impurezas. Cuando no sea posible obtener muestras de algunas impurezas o productos de degradación, los resultados deben compararse con los obtenidos mediante un procedimiento independiente. En ausencia de otra información, puede resultar necesario calcular la cantidad de una impureza basándose en la comparación de su respuesta con la del fármaco, pero el cociente entre las cantidades iguales de la impureza y del fármaco (factor de respuesta relativo) debe ser utilizado siempre que se le conozca.

Para evaluar la exactitud se emplean diferentes estimadores estadísticos, entre los cuales tenemos:

1) Para la comparación de dos métodos diferentes, aplicado en la valoración de materias primas. Se emplea los estadístico F y t.

Se acepta que ambos métodos tienen exactitudes o precisión iguales cuando el texp es menor que ttabla.

Donde Xa es el promedio; S ² es la varianza conjunta y n el número de datos.

La varianza conjunta se calcula mediante la siguiente fórmula:

Se acepta que ambos métodos tienen exactitudes o precisión iguales cuando el texp es menor que ttabla.

2) El porcentaje de recuperación es el más usado, y este es la relación que existe entre la cantidad obtenida y la cantidad real.

3) Evaluación mediante el test t. Para esto se aplica la siguiente ecuación:

Donde:

CV = Coeficiente de variación ; x=Promedio ; n=número de datos.

No existe diferencia significativa entre la recuperación media y 100 si texp es menor que ttablas, para una confiabilidad del 95%.

Evaluando la linealidad de la relación entre las concentraciones estimadas y las reales, el criterio estadístico de preferencia es que el intervalo de confianza para la pendiente este comprendido dentro de un intervalo definido alrededor de 1.0; o alternativamente que el valor de la pendiente sea cercano a 1.0.

Criterios de aceptación

Los criterios de aceptación según la categoría a evaluar, son:
1) Para la valoración de la materia prima. El Fexp debe ser menor al Ftablas o texp debe ser menor a ttablas.
2) Valoración y uniformidad de contenido. El promedio del porcentaje recuperado debe estar dentro del rango de 98% a 102%, la desviación estándar relativa debe ser menor o igual a 2.5%, el porcentaje recuperado para uno de los datos de los rangos individuales debe estar dentro del rango de 95-105%. El texp debe ser menor al ttablas para un nivel de confianza de 95%, tomando como valor verdadero 100. El Intervalo de confianza para la pendiente debe estar dentro de un intervalo definido alrededor de 1.0 o el valor de la pendiente debe ser cercano a 1.0.
3) Para las pruebas de disolución. El promedio del porcentaje recuperado debe estar dentro del rango de 95% a 105%, la desviación estándar relativa debe ser menor o igual a 2.5%. El porcentaje recuperado para los rangos individuales debe estar entre 90-110%.
4) Sustancias relacionadas o determinación de impurezas.

• Si el nivel de impurezas es menor a 0.2%, el porcentaje recuperado debe estar dentro del rango de 70-130%, y el %RSD debe ser menor o igual a 10%.
• Si el nivel de impurezas es de 0.2 o menor de 0.5%, el porcentaje recuperado debe estar dentro del rango de 80-120%, y el %RSD debe ser menor o igual a 10%.
• Si el nivel de impurezas es de 0.5 o menor de 5%, el porcentaje recuperado debe estar dentro del rango de 90-110%, y el %RSD debe ser menor o igual a 5%.
• Si el nivel de impurezas mayor o igual a 5%, el porcentaje recuperado debe estar dentro del rango de 95-105%, y el %RSD debe ser menor o igual a 2.5%.

ESPECIFICIDAD O SELECTIVIDAD

La especificidad, es la capacidad de un método analítico para obtener una respuesta debida únicamente al analito de interés y no a otros componentes de la muestra.

La metodología del ensayo varía según el tipo de método, de la siguiente manera:

1. Pruebas de Identificación. Garantizan la identidad del analito. En análisis cualitativo debe demostrarse la capacidad de distinguir compuestos de estructura estrechamente relacionada cuya presencia resulta probable. Esta capacidad debería confirmarse mediante la obtención de resultados positivos a partir de muestras que contengan el analito, junto con resultados negativos de muestras que no contengan dicho analito, y mediante la confirmación que no se obtiene una respuesta positiva de materiales con estructura similar o estrechamente relacionada a la del analito.
2. Pruebas de Pureza. Garantizan que todos los procedimientos analíticos efectuados permiten declarar con exactitud el contenido de impurezas de un analito (por ejemplo, prueba de sustancias relacionadas, límites de metales pesados, impurezas orgánicas volátiles). La selectividad puede establecerse mediante la adición al fármaco o producto farmacéutico de una cantidad de impurezas en concentraciones adecuadas, y la demostración que esas impurezas se determinan con exactitud y precisión adecuadas.
3. Valoraciones. Proporciona un resultado exacto, que permita una declaración exacta del contenido o potencia del analito en una muestra. Los métodos empleados en la valoración de un ingrediente activo farmacéutico, se pueden dividir así:

• Para método de control de calidad. Se analizan según la metodología a validar, un placebo del producto, un estándar de referencia y un placebo más analito. Si es posible se analizan placebos del producto cargados con sustancias relacionadas, precursores y/o homólogos y una mezcla de placebo, analito y dichos productos. Es importante demostrar con evidencia que los resultados analíticos obtenidos no resultan afectados por la presencia de estos materiales extraños.
• Para método indicadores de estabilidad. Se prepara un placebo reciente, conteniendo todos los ingredientes de una muestra normal, excepto el analito, un placebo cargado, un estándar de referencia, y si es posible un placebo cargado con los productos de degradación. Si se sospecha que en la fórmula hay productos que puedan interferir con el análisis, se corren estos compuestos individualmente y se determina si es necesario modificar el método de análisis o el de preparación.
  

Todas estas muestras se analizan por la metodología a validar. Si el método es por HPLC, se inyecta fase móvil, si se cuenta con arreglo de diodos, se chequea la pureza de los picos de interés en la muestra del placebo cargado, la cual debe ser mínimo 0,99 % para considerar que el método es especifico. En todos los demás casos no debe existir respuesta significativa de los excipientes o blancos, en la cuantificación de los activos.

Se analizan según la metodología a validar, placebo, estándar, placebo más analito y placebo más los productos de degradación del analito.

Si no se dispone de estándares de impurezas o de los productos de degradación, puede demostrarse la especificidad comparando los resultados de las pruebas de muestras que contengan impurezas o productos de degradación con los de un segundo procedimiento bien caracterizado (por ejemplo, un procedimiento farmacopéico u otro procedimiento validado). Estas comparaciones deberían incluir muestras sometidas a condiciones forzadas relevantes (por ejemplo, luz, calor, humedad, hidrólisis acida y alcalina, oxidación). En una valoración, deben compararse los resultados; en pruebas de impureza cromatográfica, deben compararse los perfiles de impurezas.

NOTA: Estas soluciones (sometidas a condiciones forzadas) deben ser neutralizadas previas al análisis,para evitar, en el caso de métodos como el HPLC, daños en la columna u otras partes del instrumento. Todos estos estudios no se deben llevar a cabo para analitos o componentes del placebo que según la bibliografía tengan propiedades reactivas que puedan dar lugar a condiciones inseguras al someter las muestras a las condiciones antes mencionadas.

Opcionalmente se pueden incluir muestras de estudios de estabilidad acelerado o muestras de estabilidad natural (de 2 a 3 años o más) y comparar con los resultados iníciales.En el caso de los métodos no selectivos, como por ejemplo los métodos volumétricos la especificidad para los componentes de una muestra, es sustentada con los resultados de exactitud y linealidad del método, si este ha cumplido con dichos criterios de aceptación.

Criterios de aceptación

Los documentos de ICH afirman que cuando se utilizan los procedimientos cromatográficos, deberán presentarse cromatogramas representativos para demostrar el grado de selectividad (se debe manejar una escala reducida, que permita observar bien las impurezas o productos de degradación) y los picos deberán identificarse adecuadamente, aquellas impurezas desconocidas deberán ser identificadas con el tiempo de retención relativo, tomando como referencia el activo, la resolución o la relación altura/valle, cromatográfica entre los picos próximos al pico de interés debe ser mayor de 1.0.
Las pruebas de pureza de picos (por ejemplo, utilizando redes de diodos o espectrometría de masa) pueden resultar útiles para demostrar que el pico cromatográfico del analito no puede atribuirse a más de un solo componente. Se acepta que el pico de interés tiene una pureza de pico correcta, cuando el valor del umbral es mayor de 990.

El placebo está constituido por todos los excipientes y recubrimientos (tintas, dispositivos de sumersión y cubiertas de cápsulas se incluyen cuando corresponda) sin el ingrediente activo. La interferencia del placebo puede determinarse pesando las muestras de la mezcla del placebo y disolviéndolas o pesándolas en el medio de disolución a las concentraciones que se puedan encontrar durante la prueba. Es preferible realizar este experimento a 37°C comparándolo al 100% del estándar, por la formula:

100C(Ap/As)(V/L)

En donde C es la concentración, en mg por mL, del estándar: Ap y As son las absorbancias del placebo y del estándar respectivamente; V es el volumen, en mL, del medio; y L es el valor declarado, en mg. La interferencia no debe exceder de 2%.
Para productos de liberación prolongada, puede ser más apropiado usar una versión del placebo de la forma farmacéutica terminada que las mezclas, ya que la formulación del placebo liberará varios excipientes de cierta manera que reflejará el producto mejor que una simple mezcla de excipientes. En este caso, puede ser necesario evaluar la interferencia potencial en puntos múltiples de muestreo en el perfil de liberación.

Si la interferencia del placebo excede el 2%, entonces puede requerirse, para evitar la interferencia, una modificación del método-tales como:

1. Elegir una longitud de onda.
2. Sustraer la línea base empleando una longitud de onda mayor o
3. Utilizar HPLC. Cuando están presentes otros fármacos activos o hay significativos niveles de degradación, es necesario demostrar que estos no afectan demasiado los resultados. Un procedimiento para lograrlo es medir la matriz en presencia y ausencia del otro fármaco activo o producto de degradación; toda interferencia no debe exceder el 2.0%.